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生物传感器简述

2014-03-07 sensor 800

一、绪言

在科学的领域里面,所有研究者几乎都有一种共识─”无法测量的东西,我们就无从真正去了解”。此一共识将它说成”准则”并不为过,尤其在快速发展的生物或医疗科技领域中,特别感触良深,因为影响进步的阻力,通常受制于测量方面的因素。生物传感器虽然仍在发展中,虽然已有部份的成果已商品化,然绝大部分的研究成果,却离商品化、实用化仍有一段相当遥远的距离。生物传感器可以期望符合某些及重要测量的需求,特别在药品、代谢与其他生物分子间交互作用的测定上。虽然有很多型号的传统分析仪器可以达到类似的目的,但生物传感器最独特的地方就是来自生物体的元件与其所具备的高特异性、高灵敏度或高选择性,与即时输出(real-time output)等特性,而且真实地结合元件当作传感器或探针构造的一部分部由于生物传感器的接近”自然”的特性,因此可以预期它的主要应用至少在五个领域,医药及动物药品,生物科技,食品与农业,环境监测,军事防御用途等。

二、生物传感器的定义与其发展历史回顾

生物体本身就具有各式各样的化学量感受器,包括味觉、嗅觉、内分泌系统的荷尔蒙受体,神经传导系统的神经化学传递物质与受体蛋白质,酵素与基质及免疫系统中的抗体─抗原等等。因此,生物体本身实际上是一个化学受体(chemoreceptors)的集合体。这些化学受体均具有高度的特异性/选择性与灵敏度,而且绝大部分属于受体蛋白质分子。生物传感器定义为”使用固定化的生物分子(immobilized biomolecules)结合换能器,用来侦测生体内或生体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生回应的一种装置”。

生物传感器由两个主要关键部份所构成,依违来自于生物体分子、组织部份或个体细胞的分子辨认元件,此一元件为生物传感器信号接收或产生部份。另一为属于硬体仪器元件部份,主要为物理信号转换元件。因此,如何已生化方法分离、纯化甚或设计合成特定的生物活性分子(biological active materials),结合精确而且回应快速的物理换能器(transducers)组合成生物传感器反应系统,实为研究生物传感器的主要目的。

生物传感器的发展,自1962年Clark和Lyon两人提出酵素电极的观念以后,YSI公司于七零年代即积极投入商品化开发与生产,开启了第一代生物传感器于1979年投入医检市场,最早的商品为血糖测试用酵素电极。YSI公司的上市成功与八零年代电子资讯业的蓬勃发展有很密切的关系,并且一举带动了生物传感器的研发热潮。Medisense公司继续以研发第一代酵素电极为主,于1988年由于成功的开发出调节(mediator)分子来加速回应时间与增强测试灵敏度而声名大噪,并以笔型(Pen 2)及信用卡型(companion 2)之携带型小型生物传感器产品,于1988年上市后立即席卷70%以上的第一代产品市场,成为生物传感器业的盟主。第二世代的生物传感器定义为使用抗体或受体蛋白分子识别元件,换能器的选用则朝向更为多样化,诸如场效半导体(FET),光纤(FOS),压电晶体(PZ),表面声波器(SAW)等。虽然第二世代的生物传感器,自八零年代中期即开始引起广泛的研发兴趣,但一般认为尚未达医检应用阶段,预定相关技术须待世纪末前方能成熟。目前可称的上市二世代的生物传感器产品为1991年上市的瑞典商Pharmacia所推出的BIAcore与BIAlite两项产品。Pharmacia公司于1985年成功地开发出表面薄膜共振技术(SPR, Surface Plasma Resonance),利用此一光学特性开发出可以于10-6g/ml到10-11g/ml之低浓度下,进行生物分子间交互作用的即时侦测式生物感测仪器。第三世代的生物传感器定位在更具携带式,自动化,与即时测定功能,预测在二十一世纪初期可以达到上市目标。至于第四世代具侦测/信号输出/控制/自我组合/自我修补与复制等功能的生物传感器将于何时出现,则尚无法预估。

三、生物传感器的类型

生物传感器微生物电子产品(bioelectronic product)。为了能够获得最佳的信号传递,固定化的生物元件通常与信号转换元件紧密地接合在一起。基本上,由信号产生方式(mode of signal generation)的不同,可以将生物传感器区分成两种主要类型:

(一)生物亲和性传感器(Bioaffinity sensors)

当固定生物元件与待测定之分析物发生亲和性结合(bioaffinity binding)时,造成生物分子形状改变与/或引起诸如荷电、厚度、质量、热量或光学等物理量的变化。此种经由分子辨认─结合类型的生物传感器有免疫传感器、化学受体传感器等,其分析可为荷尔蒙、蛋白质、醣类、抗原或抗体,而相对应的受体可为荷尔蒙受体、染剂、外源凝集素(lectins)、抗体或抗原等。

(二)生物催化型感应器(Biocatalytic biosensors)

此类传感器之信号侦测并不在于分子辨认─结合的阶段,儿戏当固定划分子与待测物反应后,产生生化代谢物质,再经特定电极侦测特定代谢物后以电子讯号表现出来。最为人所熟悉的为属第一世代生物传感器的酵素电极。目前有关此类生物传感器的两个主要研究发展方向为(1)使用酵素共軛物(enzyme conjugates)、环系酵素群(cycling enzymes)和系列酵素来组合生物传感器,(2)使用微生物细胞或动、植物组织切片或可渗透性细胞(permealized cells)等来当作分子辨认元件。

四、生物传感器设计

构成生物传感器关键技术得两个主要元件为生物辨认分子与物理换能器。在欲发展一特定功能的生物传感器前,首先必须根据选用生物分子的特性、作用机制、信号产生/输出模式、待测物浓度范围、操作环境等参数做通盘性的考虑,再慎选适当的信号转换器,亦即换能器。由选用换能器的不同,生物传感器设计时可以细分成下列数项主要技术:

(一)电化学生物传感器(Eletrochemical Biosensor)技术

此类型的传感器发展的最早,Clark和Lyons首先开发出酵素电极生物传感器,以电流计测方式测定测定溶液中葡萄糖的浓度。大部分的生化代谢型生物传感器均使用特定的电极当作讯号转换器,如溶氧电极、白金电极、氨电极、二氧化碳电极与pH电极等。而信号输出的方式又可分为电流、电压与导电度测定等方法。酵素电极的测定原理为利用特定电极量取反应產物之生成量或反应物之消失量。例如使用葡萄糖氧化酵素(glucose oxidase,GOD)固定化在氧电极尚来定量反应溶液中氧气的浓度,当葡萄糖被GOD氧化时:

GOD Gloucose+O2──── Gluconolactone+H2O2

溶液中氧气递减现象可由溶氧电极测量出,而氧气消耗量正与葡萄糖浓度成正比例关系。一般而言,酵素电极之测定浓度范围约在mM到ppm之间,其回应时间在0.1到10分鐘。电极之安定性(Stability)在1到100天之间。另外,此类型生物传感器液可使用含有活性酵素之整体细胞,如微生物、动、植物细胞切片来製成特定用途之生物传感器。

(二)半导体离子传感器─离子选择性场效电晶体(ISFET, Ion Sensitive Field Effect Transistor)

此类型的半导体係由金属绝缘场效性晶体(MISFET, Metal Insulating Field Effect Transistor)改良而成,使用不易被水分子及离子物质侵入的氮化硅(SiN4)膜取代MOSFET使用的金属氧化物薄膜。再于氮化硅膜上共价接合一层已固定化有生体活性物质的薄膜当作离子感应膜,另以Ag/AgCl电极当作参考电极,如图二所示。此类传感器可直接安置于溶液中,当待测物与离子感应膜上的接受器产生反应后,离子感应膜即产生界面电位变化,信号则由漏极(drain)输出。ISFET的离子感应膜上如选用适当的离子选择性材料,即可感应出不同离子。到目前为止已有可以感应Na+、K+、NH4+、Ca+2、Ag+、Li+、Cl-、Br-等离子的ISFET。又,假如以固定化酵素薄膜代替离子感应膜,则此种设计称为ENFET(酵素场效性半导体)。已见诸文献的则有盘尼西林(penicilin)传感器,尿素传感器,葡萄糖传感器,乙醯胆硷(acetylcholine)传感器等。

ISFET的优点微:(1)超小型,可利用半导体技术做微加工,(2)可多重化,做成同时测定多种成份的阵列传感器,(3)应答快速,经由离子感应膜的超薄化,可以缩短回应时间。

(三)光纤生物传感器(Fiber-optic biosensor)

光纤传输在近代先端科技,尤其在资讯传输路径,确保信号品质上扮演极重要角色。光纤利用内部全反射来导光,不易受电气杂讯及其他外在因素影响,而且外型纤细、传输失真小(每公里1.5mm波长以下)。光纤应用在计测、控制系统时,必须配合可靠性很高的高性能光传感器。图三a及b为光纤传感器的光学路径与典型的仪器系统。光纤生物传感器的构造为在光纤的纵切端面,固定化一层适当的指示剂材料(例如生物萤光物质,化学发光物质或染料),当测定容易内发生生化反应时,由指示剂材料的变化产生光学讯号。该光学讯号可藉由仪器系统量取吸光量、萤光强度、反射强度、顏色、混浊度或冷光(luminesence)变化等参数值来达到测定目的。为达上述目的,光纤感测所须具备的技术包括椭圆镜术(ellipsometry),内部反射(internal reflectometry),渐逝波(evnescent wave),光散射(light scattering)与折射指数测量(refractive index mesurement),表面薄膜共振(surface plasma resonance),萤光偏极化(fluorescence polarization)等。

近年来,在光纤生物传感器发展上有两项极为热门的关键技术,分别为渐逝波(简称EW)与表面薄膜共振(简称SPR)技术。瑞典商Pharmacia公司于1991年推出的BIAcore与BIAlite生物感测产品,即是基于成功地掌握SPR关键技术所致。兹将此两项技术简述如下:

1.渐逝波技术(Evanescent wave technology)

渐逝波现象是半随著全内反射而产生的。在全内反射发生的介面,理论上虽然入射光线会全部向内反射并在光纤内传导,但是其能量并非全部侷限在n1的介质中,此时,一种称为渐逝波(evanescent wave)的电磁场以垂直于光纤轴心方向,向n2介质穿透约少一个波长的距离。根据Maxwell’s equation,此电磁场以正弦立波存在于n1介质中,而其震幅在n2介质中并不会变成零,而是以指数衰减方式逐渐减少。方程式1中,E是离此交界面的任一距离的电磁场的振幅,E0是在表面的最大振幅,dp为振幅衰减至原来的1/e的穿透深度,而Z为距交界面的距离。穿透深度dp可从方程式2求得,其中 为入射光的波长。若入射光的波长为500nm,则穿透深度大约为100nm,而电磁场强度大约为界面时强度的36%。

水溶液的折射率约等于1.33,如果用氢氟酸侵蚀掉光纤的外覆层(cladding),再将光纤核心放入水溶液中,则全反射仍然产生,并在液相环境中产生渐逝波。此时,如果在此介面的渐逝波能量涵盖范围内存在有萤光物质,则此萤光物质会被激发而产生波长较激发光长的萤光,此萤光亦会进入光纤中,并且同样地以全内反射的方式在同一条光纤中传导,此时可在光纤另一端安置光侦测器来达到感测目的。因此,我们可以在光纤表面固定抗原或抗体,利用此一渐逝波现象结合萤光免疫反应,发展为光纤免疫生物传感器。

2.表面薄膜共振技术(Surface Plasma Resonance Technology)

表面薄膜共振(SPR)係一种光学现象。当光束于玻璃介质内传导时,于光路径上遇金属薄层界面交接处产生内全反射(total internal reflection)时所伴随的光学物理现象。由于光束的电子震荡与金属薄层内金属原子产生共振作用时,在特定的反射角范围内会引起反射强度的急剧变化,此一反射角(angle of reflection)又称为共振角(resonance angle),如图五(a)所示。共振角随著非照射面金属薄层邻近介质的折射指数(refractive index)之不同而变化。因此,虽然入射光束在传导路径上碰到金属薄层界面时会产生全反射,但事实上,有部份光能量会穿透界面进入到非照射端的介质中,穿透距离大约为一个波长的距离左右,此一现象如同前节所述的渐逝波一样。当环境介质因组成、浓度或成份改变时所导致折射係数的变化,则会藉由渐逝波的光动能反应到共振角的变化上。与金属面邻接的介质部份之有效回应距离约距金属表面300nm左右,由于折射指示值随该有效距离内之溶液的浓度而改变,因此SPR技术可以用来定量靠近感测电极表面之待测物浓度,而不需预先做任何标识(labelling)。

图五(b)所示则为SPR技术应用在即时式(real-time mode)免疫感测的反应强度对时间作图。纵轴单位为SPR回应讯号,为测量共振角(resonance angle)的变化所获之任意单位(arbitrary units)称之为共振单位(resonance unit, RU),1000RU的变化相当于1ng/mm2的表面蛋白质浓度变化;横轴为时间,以秒为单位。当测试开始时(t=0),感测电极表面只有抗体存在,RU维持在基础稳定平衡状态;当抗体-抗原产生反应时(t=150),可以明显看出RU急剧上升,直到另一较高稳定平衡状态;继续进行与第二抗体(secondary Ab)反应(t=300)时,亦可看出RU再度急剧攀升至另一高阶稳态平衡;最后以解离剂宜除抗体表面的结合物(t=350),可以看出RU又回到起始值之稳定平衡状态,完成一个循环得测试。由于RU值与电极表面的物质浓度成一相关比例,因此SPR技术可以用来进行定量分析。另外,由于是即时式侦测,故可以由反应强度-时间图直接获得亲和动力学(associate kinetics)与解离动力学(dissociate kinetics)方面的资讯。

(四)压电晶体生物传感器(Piezoelectric quartz crystal biosensor)

压电晶体在近年来才被引用到生物传感器的转换器使用。最早的应用微作微质量天平使用(QCM, quartz crystal microbalance)。早期的压电晶体传感器,用在测定空气污染物质测定,然使用在电极表面具有感测功能的包覆材料大多为非生物性物质(abiotics)。Guilbault(1983)首先发表使用甲醛去氢酵素(formaldehyde dehydrogenase)与辅因子固定化在晶体电极上用来测定空气中的甲醛成份,才开始引发生化界的重视。然而截至目前为止,有关压电晶体生物传感器的研究尚在起步阶段而已。

典型的压电石英晶体如图六(a)所示,其石英版通常为两片金属电极(例如金、银、铝和镍等)如同三明治般地夹在中间。电极的作用为沿晶片表面垂直方向导入一震荡电场(oscillating electric field)。此一震荡电场迫使晶体内部结晶格子产生类似立波(standing wave)的机械震荡行为。假使石英板的厚度一定,此种机械性震荡可以以一定额的频率表现出来。而谐振频率(resonant frequency)很容易藉著导入一适当的震荡电路来测量出。此种由于机械与电子两种震荡交联所产生的谐振频率决定于下列数顿因素,其间某些因素在正常情况下均为固定值包括石英晶片的物理性质如厚度、密度如剪力係数,某些情况下,下列因素亦保持在一固定值,包括与气体或液体接触时晶体表面之密度、黏度及横跟晶片两面间之压力差与温度等。而改变晶体频率最大的因素为电极的质量与外加附著在电极上的薄膜之质量变化。

Sauerbrey氏首先导出积层在石英晶体之金属膜质量与频率变化的关系式,用来描述大部分场合下,尤其在气相状态下压电晶体之质量变化与频率应答的关系。

 F=-2.3×106F2 M/A

其中 F表示因质量负载所致的频率变化(Hz);f为石英晶体的震荡频率; M为电极上外覆的质量负载(g);A则表示金属电极的面积。由上式关系可以得知,随著质量负载( M)的增加,频率衷减值( F)愈大。计算其频率应答范围可以得知侦测极限值可以达到ppt(10-12g)位準。压电石英晶体不仅可以在气相环境下产生震荡频率,同时当与液体接触时,亦会随溶液之密度、黏度性质改变而产生频率变化。Kanazawa等人首先导出下列关系式:

 F=-2f03/2(μsφs/μqφq)1/2

其中μs为溶液的黏度(viscosity); φs为溶液的密度(density); μq与φq则分别代表石英晶体之黏度与密度。由于上式中,f0、μq、φq等项均为常数,因此可知于液相状态下压电晶体之频率衰减值主要係受溶液的黏度与密度变化所影响。由此,只要在压电晶体电极面上固定化上一层生物分子辨认薄膜,即可用来侦测相对应的化合物;如抗体-抗原,酵素-基质,激素-受体等。由于压电晶体侦测灵敏度可达10-12g位準,因此可适用于一般生物分子阶层的感测。

压电晶体生物传感器截至目前为止,已发展出数种在气相环境下测定挥发成分的感测探针,如甲醛、有机磷化合物、巴拉松如古柯硷等。吴、王等人利用棤仿动物嗅觉辨认的原理,已成功开发出多阵列压电晶体嗅觉生物传感器-人工鼻,此一具「人工嗅觉」功能的生物感测系统可应用于恶臭污染侦测、酒类、食口及化粧品工业上使用。未来将更朝医疗「呼气」诊断的目标迈进,期能藉由呼气中呈现的特定「气味」来瞭解疾病的线索,以作为诊断的参考依据之一。另外,应用压电晶体结合特定生物辨认分子的传感器有:病原菌微生物量的测定,凝血素浓度测定,免疫球蛋白测定,生长激素测定,基因探针生物传感器爱滋病与安非他命传感器等。财团法人生物技术开发中心更在此方面积极投入,目前已完成自动化多阵列压电晶体亲如性生物感测系统的开发。该系统主要由(1)传感器硬体,(2)资料擷取控制与分析部分,(3)卡匣式压电晶体生物感测探针等三部分所构成,系统原理为将生物识别分子与压电晶体之金电极结合,利用压电晶体之共振频率改变与微质量/黏度改变相关之平衕特性,来侦测生物识别分与待测对应物间之即时式交互反应,以达到定性或定量分析的目的。(文:吴宗正)

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